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基本信息

5月9日，上海交通大学医医院普外科黄陈主任医师作为通讯作者，在MolecularCancer（IF10.）发表了题为“CircularRNAcircCCDC9actsasamiR-2-3pspongetosuppresstheprogressionofgastriccancerthroughregulatingCAV1expression”研究论文，系统研究了环状RNAcircCCDC9在胃癌进展中的作用机制。

这也是继去年8月份之后（可点击查看详情），该课题组再次在MolecularCancer上发表胃癌领域circRNA研究成果。文章中全转录组测序服务工作由欧易生物完成。

研究背景

胃癌是最常见的消化道恶性肿瘤之一，由于对早期胃癌的筛查不足和疾病的隐匿性，多数患者初诊即已处于胃癌晚期。目前胃癌的预后仍不尽人意，因此探究胃癌发生发展的具体分子机制，对于胃癌的诊治具有重要意义。

环状RNA（circularRNA,circRNA）是真核生物中一类重要的内源性非编码RNA，近些年研究表明circRNA广泛参与肿瘤的发生和发展，影响肿瘤的生长增殖和侵袭转移等过程。以胃癌为例，circNHSL1就是一个与胃癌转移相关的circRNA分子，通过circNHSL1/miR--3p/SIX1轴调控了胃癌转移。但胃癌中circRNA的作用和功能仍有待深入研究。

研究结果

1、circCCDC9在胃癌组织中表达下调

首先对6个胃癌样品和配对的癌旁样品进行全转录组测序，共检测到个circRNA，在肿瘤组织中有52个circRNA表达上升、33个表达下降（下左图）。其中表达下调最为显著的一个circRNA是Has_circ_，它由基因CCDC9外显子6和外显子7反向剪接形成，因此将此circRNA命名为circCCDC9。

利用RT-PCR在48个胃癌样品中进行检测（右上图）、利用原位杂交（ISH）在54个胃癌样品中进行检测，均显示该circRNA表达量发生了显著下调。与正常胃上皮细胞系相比，不同的胃癌细胞系中circCCDC9表达量也明显降低（右下图）。circCCDC9表达水平与肿瘤大小、淋巴结转移、TNM分期呈负相关，与胃癌患者预后呈正相关。

为了证明circCCDC9是环状RNA，利用divergent和convergent两对引物，并通过一代测序（下图A）、以cDNA和gDNA为模板进行PCR（下图B）、RNaseR处理（下图C）的方法得以验证。亚细胞定位显示circCCDC9主要分布于细胞质中。

2、circCCDC9在体外可以抑制胃癌细胞增殖、迁移和侵袭

为了研究circCCDC9在胃癌中的作用，在MKN45细胞中利用siRNA对circCCDC9进行knockdown，但不影响CCDC9mRNA的表达水平（图B）；在AGS细胞中过表达circCCDC9（图C）。knockdowncircCCDC9后，结果显示细胞增殖能力增强（图D-F），woundhealing和transwell实验显示细胞的迁移、侵袭能力也得以增强（图G-H），过表达circCCDC9则呈现相反趋势。

3、miR-2-3p在胃癌中高表达并与肿瘤进展和预后相关

为了研究circCCDC9对胃癌的调控机制，并考虑到circCCDC9主要分布于细胞质中，文章从ceRNA的角度进行探索。首先利用生物信息分析的手段预测有5个miRNA可以靶向到circCCDC9，RT-PCR显示只有其中的miR-2-3p在细胞和组织中均与circCCDC9表达量呈负相关（图B-D）。分析也显示miR-2-3p与肿瘤大小、淋巴结转移、TNM分期呈正相关，与胃癌患者预后呈负相关（图G）。

4、miR-2-3p通过靶向CAV1促进肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭

接下来研究miR-2-3p的作用。多个软件共同预测显示miR-2-3p可能靶向的基因有6个，其中的CAV1是一个已报道的与胃肠道癌进展相关的基因。在胃癌细胞系中转入miR-2-3pmimic以提高miRNA表达量，RT-PCR显示CAV1表达量显著下降（图B）。同时利用荧光素酶报告系统检测显示，miR-2-3p可以与CAV1序列直接结合，而不能结合碱基突变的CAV1（图C-D）。检测结果还表明，miR-2-3p过表达后，肿瘤细胞增殖能力增强，细胞的迁移、侵袭能力也得以增强。而通过转入miR-2-3pinhibitor降低表达量则呈现相反趋势。

5、circCCDC9作为miR-2-3p的分子海绵以调控CAV1的表达

上述结果表明在胃癌进展中，circCCDC9、miR-2-3p、CAV1都有变化，接下来研究它们三者之间的调控关系：

1）RT-PCR和WB显示，knockdowncircCCDC9可以下调CAV1的mRNA和蛋白质表达水平，下调miR-2-3p可以挽救CAV1的上述表达下降（图A）。同样，过表达circCCDC9可以上调CAV1的mRNA和蛋白质表达水平，上调miR-2-3p可以抑制CAV1的上述表达上升（图B）。

2）荧光原位杂交显示，circCCDC9与miR-2-3p共定位于细胞质（图C）。

3）荧光素酶报告实验表明，miR-2-3p可以直接结合circCCDC9，而不能结合含突变碱基的circCCDC9（图D）。

4）RIP-PCR显示，靶向Ago2蛋白的抗体可以同时pulldown到circCCDC9和miR-2-3p（图F-G）。

5）生物素标记的circCCDC9探针可以pulldown到miR-2-3p，生物素标记的miR-2-3p探针也可以pulldown到circCCDC9（图H-I）。

6）RT-PCR显示，胃癌组织中，circCCDC9与CAV1表达正相关、circCCDC9与miR-2-3p表达负相关、CAV1与miR-2-3p表达负相关。

7）同时细胞实验证实，由circCCDC9所引起的肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭能力的改变，可以被miR-2-3p所抑制。

以上结果表明circCCDC9通过直接结合miR-2-3p以上调CAV1表达，以ceRNA的机制参与对胃癌肿瘤进展的调控。

6、体内过表达circCCDC9可以抑制肿瘤生长与肝转移

以上均是在体外进行的研究，接下来为了研究circCCDC9在体内是否起到同样的调控作用，将过表达circCCDC9的AGS细胞接种到裸鼠。接种28天后，过表达circCCDC9的裸鼠肿瘤体积与重量显著低于对照组（图A-C），RT-PCR显示CAV1表达量显著高于对照组。构建肝转移模型，显示过表达circCCDC9的裸鼠肝转移程度较低。

研究结论

本研究通过全转录组测序，发现了一个胃癌进展相关的circRNA分子——circCCDC9，体内体外实验表明，它对肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭起到抑制作用。进一步的机制研究表明，circCCDC9对胃癌的抑制作用是通过circCCDC9/miR-2-3p/CAV1轴实现的：circCCDC9作为ceRNA，竞争性结合miR-2-3p，从而间接调控了CAV1的表达水平。circCCDC9和miR-2-3p均有望成为胃癌预后的biomarker，为胃癌的诊断和治疗提供了新的分子靶点。

参考文献

LuoZ,RongZ,ZhangJ,etal.CircularRNAcircCCDC9actsasamiR-2-3pspongetosuppresstheprogressionofgastriccancerthroughregulatingCAV1expression.MolCancer;19(1):86.(IF:10.).

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