CD19CART技术在B细胞淋巴瘤及白

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医脉通导读近10多年来，淋巴系统肿瘤的临床治疗取得了很大进展，抗CD20单抗广泛应用于CD20阳性的B细胞非霍奇金淋巴瘤，取得良好的疗效，已经成为临床一线用药。但是，由于淋巴瘤和急慢性淋巴细胞白血病的细胞表面往往仅有CD19抗原，美罗华一类的抗CD20抗体对其无明显治疗作用，因此迫切需要一种新的治疗方法来提高淋巴瘤和急慢性淋巴细胞白血病的治愈率。

嵌合抗原受体T细胞免疫疗法（CART）是一种嵌合抗原受体的T细胞，通过基因修饰使T淋巴细胞表达特定的CAR，该细胞可以特异性识别靶抗原，杀伤靶细胞。CART细胞具备针对特定肿瘤抗原的高度亲和特性，从而能高效杀伤表达该抗原的肿瘤细胞。CD19在不同分化阶段的B淋巴细胞表面均有特异性表达，95%以上的B细胞淋巴瘤和B淋巴细胞白血病均表达CD19抗原。建立识别CD19嵌合抗原受体的CART细胞，可以实现对B淋巴细胞肿瘤的治疗目的。本文将主要论述CD19-CART细胞抗淋巴细胞肿瘤的机制、CD19-CART细胞在B淋巴系统疾病中的临床应用以及CD19-CART细胞治疗的不良反应和风险。

CD19-CART细胞抗淋巴细胞肿瘤机制

细胞毒T细胞是经抗原递呈细胞（APC）激活的CD8+T淋巴细胞。研究表明T细胞的活化依赖双信号途径活化增殖为细胞毒T细胞：其中第一信号途径为APC上的MHC分子-抗原肽复合体和存在T细胞上的T细胞受体结合，第二信号途径为APC表面的B7共刺激分子与T细胞表面的CD28分子结合。当细胞毒T细胞与携带相同MHC分子-抗原肽复合体的肿瘤细胞相遇时与之结合，释放穿孔素，可以导致细胞溶解。此外，还能分泌颗粒酶，诱发靶细胞的凋亡。

CART设计的关键是选择适当的肿瘤抗原作为靶标，由于B淋巴细胞的各个分化阶段多表达CD19，而其他非B细胞没有CD19的表达，因此针对CD19的CAR是目前临床上研究最多的CART细胞，在恶性B淋巴细胞肿瘤如B细胞急性淋巴细胞白血病（ALL）、慢性淋巴细胞白血病（CLL）及非霍奇金淋巴瘤治疗中被广泛临床试验。此外，动物实验已证实，针对CD19的CART细胞能对表达CD19+的B淋巴细胞肿瘤产生有效的攻击。在存在免疫缺陷的小鼠体内，输入CD19+靶向T细胞后，发现CD19+肿瘤细胞被有效清除。

CD19-CART细胞的临床应用

1CD19-CART细胞在B细胞淋巴瘤中的应用

CD19-CART细胞的研究是目前对于B细胞淋巴瘤的热点。年Kochenderfer等首先报道了CD19-CART细胞在治疗复发难治滤泡淋巴瘤的作用。年Kochenderfer等报道了8例复发难治B细胞淋巴瘤患者均接受CART细胞治疗，包括4例CLL，3例滤泡淋瘤及1例脾边缘区B细胞淋巴瘤。结果显示8例患者中1例达完全缓解（CR），5例达部分缓解（PR），1例疾病稳定；对患者的细胞因子IFN-γ和TNF水平检测，发现其中4例明显升高。年Kochenderfer报道了14例复发难治患者，其中8例为原发纵隔的大细胞淋巴瘤（PMBCL）或弥漫大B细胞淋巴瘤（DLBCL），4例CLL，1例惰性NHL，1例边缘区B细胞淋巴瘤（SMZL）；8例PMBCL或DLBCL中5例治疗后达CR或PR。年Rosenberg团队再次增加了他们的研究样本，15例难治复发B淋巴细胞肿瘤患者接受CART治疗，其中9例为DLBCL，4例为CLL，2例为惰性淋巴瘤，结果8例达CR，4例达PR，1例淋巴瘤稳定。

美国国立癌症中心在CD19-CART治疗中也取得了许多成果，他们利用反转录病毒转染的19-28ZCART治疗B淋巴细胞肿瘤。27例患者中22例有效，获得CR或PR，其中1例患者CR持续37个月。在年第56届ASH会议上该中心报告了最新进展：CART治疗9例难治性DLBCL，并联合减低剂量化疗，结果1例达CR，4例达PR，2例预后差。

2CD19-CART细胞在B细胞淋巴细胞白血病中的应用

CD19-CART细胞能够识别B淋巴细胞白血病的特异性CD19靶点，通过释放穿孔素及颗粒酶等细胞因子，对表达CD19抗原的B淋巴细胞进行攻击，从而促使机体清除恶性淋巴细胞。美国斯隆-凯特琳癌症中心在治疗难治复发的B-ALL应用了自体19-28zCART技术，16例患者中14例获CR，甚至对移植后复发的Ph+ALL也有效。通过CART治疗也为异基因造血干细胞移植创造了条件。宾州大学也报告了应用19-CDzCART治疗B细胞肿瘤结果，30例难治复发的B-ALL，27例达CR，6个月无病生存率达67%，总生存率78%。

Brenyjens等应用第2代CART细胞，即转染了CD28/CD3-ζ的CD19特异性CART细胞，治疗5例复发B-ALL患者。用PCR测序检测CART细胞数量和功能，结果显示CART细胞在体内可迅速产生抗肿瘤作用，微小残留病检测很快转阴，均达CR。Grupp等报道，应用第2代CART细胞治疗的2例难治性和复发性B-ALL患儿均获CR，其中1例为脐带血异基因造血干细胞移植后复发，且对CD3、CD19双特异性单克隆抗体blinatumomab耐药。采用慢病毒载体转染技术产生的包含4-1BB的二代CART细胞，输注T细胞数为（1.4×～1.2×）/kg，细胞增殖倍以上，输注后2周外周血淋巴细胞和中性粒细胞均明显升高，淋巴细胞主要为T细胞，尤其是CART细胞。CART细胞在脑脊液中也可高水平存在至少6个月，而2例患者并无中枢神经系统白血病，预示CART细胞对中枢神经系统白血病的预防和治疗作用。不良反应上，主要有粒细胞缺乏、发热、低血压、急性血管渗漏综合征、急性呼吸窘迫综合征、ALT和AST升高等，无急性毒性反应。

年第56届ASH会议，诺华在会上公布了业界期待的CART免疫疗法CTL的最新临床数据，39例复发难治ALL患儿接受CD19-CART细胞治疗，92%（36/39）达CR，随访6个月，69%（27/39）处于持续缓解状态，总生存率达74%（29/39）。在用CD19-CART细胞治疗24例CLL的研究中，50%（12/24）达CR；随访9个月，总生存率达67%（16/24）。

年ASH会议上，美国宾夕法亚大学公布了他们的最新临床研究成果。14例复发难治CLL患者接受CART细胞治疗，输注CART细胞中位数为1.4×（0.14×～5.90×）。截至时间为年7月15日，据统计全部患者的中位随访时间为9.4（4～35）个月，有效患者为16（5～35）个月。结果发现14例患者中8例治疗有效，其中3例达CR，对患者分别随访11、34和35个月，均未复发；5例患者达PR，其中2例在输注4个月后出现复发。

年ASH会议上报道了宾夕法尼亚大学的一项Ⅱ期研究成果，目的为了发掘发挥抗肿瘤效果的CART细胞最佳数量。该研究入组10例复发难治CLL患者，所有患者给予CART细胞治疗，其中6例接受低数量（5×）治疗，4例接受高数量（5×）治疗，中位随访3个月，2组患者的有效率和不良反应均差异无统计学意义。

CD19-CART细胞治疗具体实施方案

1患者T细胞的获得

采集患者外周静脉血～ml，ml约含有（2～3）×个单个核细胞，经过体外分离、纯化T细胞。

2体外制备特殊的CART细胞

慢病毒转导分离纯化的T细胞；经过培养增加效应细胞数量；严格质控、严格无菌操作，保证制备的CART细胞可以应用于临床治疗。

3治疗方案

患者筛选和治疗时机选择

选择的患者为CD19+复发难治的B细胞淋巴瘤或白血病患者，没有自体或异体干细胞移植适应证，或接受目前治疗方案后预后较差（几个月到2年的存活）；预计生存＞12周；ECGO评分0～2，或KPS评分＞60；肌酐＜2.5mg/dl；AST/ALT＜3×正常上限；胆红素＜2mg/dl；自体干细胞移植复发后患者不符合其他优先治疗方案；可以进行静脉采血，并且无相关禁忌；自愿签署知情同意书。

治疗前化疗

患者细胞治疗前接受适当的化疗，减少体内肿瘤细胞数量，减轻CART细胞治疗后发生细胞因子释放综合征（CRS）的概率和严重程度。化疗将开始于CD19-CART细胞回输前5～10天，进而保证在回输前的1～2天完成化疗。

因此，化疗的起始时间取决于化疗的跨度。化疗的目的是诱导淋巴细胞缺失，促进移植和保持CD19-CART细胞的稳定扩增。化疗的选择也会降低肿瘤负荷。淋巴细胞清除方案不是本试验方案的一部分，可以根据肿瘤专家选择给药。化疗的选择依赖于患者的基础疾病和既往治疗。氟达拉滨30mg/（m2·d）×3d和环磷酰胺mg/（m2·d）×3d是可以选择的化疗药，由于许多经验表明这些药物的使用能够促进过继细胞免疫治疗。其他FDA批准药物的化疗方案同样合适，包CHOP，HYPerCVAD，EPOCH，DHAP，ICE等。

CART细胞回输

采用剂量分次输注，从小（1×）到大的方式，将制备好的CART细胞回输给患者。首次剂量采用d0，1，2爬坡剂量，d0给药10%的细胞，d1给药30%的细胞，d2给药60%的细胞。如果患者有足够的CD19-CART细胞可用，且患者对第1次回输剂量能够耐受，第2次CD19-CART细胞将于第11天向患者给药（剂量～CART细胞，或～T细胞）。

输注后治疗严密监控患者是否有临床并发症

CD19-CART细胞回输后不良反应包括短暂发热、畏寒、恶心和寒颤。对大量肿瘤细胞破坏产生的CRS等情况给予相应的预防及处理。推荐受试者在CD19-CART细胞回输前，预先口服对乙酰氨基酚mg，以及口服或静脉注射25～50mg盐酸苯海拉明。如果乙酰氨基酚不能缓解持续发烧的患者，建议使用非类固醇消炎药。通常不建议患者系统性使用皮质类固醇药物，如氢化可的松、泼尼松、泼尼松龙或地塞米松，除非在危及生命的紧急情况下才可使用，因为这些药物对CART细胞治疗有不良影响。

4治疗的后续跟踪

患者在回输CART细胞后第1个月，每周随访1次，受试者在2～6医院复查，回输后的2年医院复查，对疾病情况及疗效、安全性进行评估。

CART细胞治疗不良反应和潜在风险

1CRS

CRS是CART细胞治疗常见的不良反应之一，CRS是高级别免疫激活所导致的一种非抗原特异性毒性，与包括IL-6和IFN-γ在内的细胞因子循环水平的升高相关。其发生机制为静脉滴注CART后患者T、B淋巴细胞，NK/T细胞和巨噬细胞等释放大量的细胞因子、趋化因子，而这些炎症介质导致的炎性反应会引起组织损伤，导致微血管病变、心脏衰竭甚至死亡。临床表现为恶心呕吐、头痛头晕、心率增快、血压下降、皮疹、胸闷气促等。

CRS的最新管理指南将其分为5个级别，Ⅰ级无生命危险，一般以发热为主，对症处理即可；Ⅱ级及以上级别均需不同的干预及支持治疗。降低CRS的方法包括适当改变细胞培养方法或者在输注细胞后使用药物来阻断细胞因子的作用，使CART细胞在治疗中所产生的细胞因子减少，免疫抑制剂托珠单抗（一种抗IL-6受体抗体）和激素可以扭转该综合征。另外一种方法为将自杀基因导入CART细胞，当出现CRS时可以启动自杀基因，降低CRS发生。

2脱靶效应

由于CART细胞与肿瘤相关的抗原具有高度亲和力，是针对肿瘤的相关抗原，但当其与正常组织表达的肿瘤相关抗原结合后，对正常组织产生毒性反应，称之为脱靶效应。为了预防脱靶效应，可通过如下方法：降低每次CART细胞量；应用抗体封闭正常组织上的肿瘤相关抗原；引入自凋亡基因系统。低球蛋白血症是CD19-CART细胞治疗的脱靶毒性之一，由于B淋巴细胞缺乏引起，可补充人免疫球蛋白。

3肿瘤溶解综合征

肿瘤溶解综合征的发生与T细胞在患者体内增殖过快、肿瘤细胞在治疗后大量死亡以及大量细胞因子的释放有关，可用碱化、水化及药物缓解。

4其他不良反应

在CD19-CART细胞治疗的临床试验中，会碰到一些少见的不良反应。Brentjens等报道1例患者在接受细胞治疗后24h，开始出现高热、气喘，后出现肾功能不全，CART细胞输入44h后患者死亡。Kochenderfer等报道，1例患者在输入CART细胞18d后出现肺部感染，为流感病毒感染，最终患者死亡。

目前仍然存在的问题

可以肯定的是CD19-CART细胞治疗技术应该是个体化的，但除了CAR本身的设计会对治疗效果产生影响外，应用时机、患者的基本状况、输注的剂量等，都会对临床效果产生重大的影响。不同的基因载体会影响到CART细胞功能，目前正在使用的载体有γ反转录病毒、慢病毒、质粒等。即使CAR结构相同，不同研究中心培养出来的CART细胞会有很大差别。新一代CAR的组成中加入了共刺激区，尤其是共刺激区CD28或CD的加入使细胞在体内增殖及抗肿瘤活性明显增强。

CART细胞输注的数量变化范围较大，一般在～/kg，最理想的是用最少的细胞数量获得最佳疗效，但这些还需要更多研究证实。如何提高疗效是研究的方向。Xu等通过5个中心的临床试验分析，总结出了提高CART细胞疗效的因素：预处理清除淋巴细胞；IL-2输注；CART细胞持续时间≥4周；外周血CART细胞峰值≥0.1%；IFN-γ峰值≥pg/ml；而输注的T细胞数量及CD4+/CD8+比值无明显意义。因此基于这些因素，我们可以采取相应的改进从而提高疗效，包括CART细胞的结构，从第1代到第4代的提升；输注前预处理及细胞因子应用；基因转导从逆转录病毒到慢病毒等。不良反应强度与效的关系也是目前需要研究的问题。症状出现的时间点以及CRS严重度取决于诱导药物、免疫细胞活化程度以及肿瘤负荷。大部分研究表明，回输前化疗清除体内淋巴细胞能增强抗肿瘤效应。Porter等应用CART细胞成功治疗3例CLL患者，发现CART细胞输入体内后，IFN-γ、CXCL9、IL-6以及可溶性IL-2受体等细胞因子明显增加，在输入后第23天达到高峰，骨髓中细胞因子的升高与白血病细胞的减少水平相一致。CART细胞数量与肿瘤溶解综合征出现时间以及细胞因子升高水平相一致，为减少不良反应需要慎重选择靶向抗原，并通过剂量递增研究来确定最有效和安全的剂量。

结语

应用CART细胞靶向特异性治疗CD19阳性的B细胞淋巴瘤及白血病患者，已经在临床上取得显著疗效，有望得到广泛应用。虽然目前CART治疗开展时间较短，尚缺乏大规模的样本，很多不良反应和并发症还需在临床试验中逐渐发现与解决。但是在已有报道的治疗B细胞淋巴瘤及白血病的临床试验中，CART表现了非常显著的疗效，尤其对于复发难治的患者，因此为更大规模、多中心的临床研究提供了依据。

来源：临床血液学杂志,v.30;No.(05)-

医脉通血液科

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